단백질 정량법에 대한 설명과 각각의 방법 대한 장.단점

1.분광학적 정량법(A280)

단백질에 있는 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판 잔기들은 각각 275nm와 280nm의 자외선을 흡수한다. 많은 단백질들에 있어서의 이 아미노산들의 합친 수준은 거의 일정하므로 단백질의 농도는 280nm에서의 흡광도와 비례하게 된다. 물론 예외가 있기는 하지만 순수한 단백질의 경우 단백질의 농도가 1mg/ml이고 자외선이 통과하는 경로가 1cm 일 때 280nm에서의 흡광도는 1.0이다. 따라서 대부분의 순수한 단백질의 농도는 280nm 에서의 흡광도를 측장함으로써 신속히 결정할 수 있다. 이 방법은 정량하는 데 시간이 적게 들 뿐만 아니라 정량하고 난 후의 단백질을 완전히 회수하여 재 이용할 수 있는 이점이 있다. 자연물들에는 280nm에서 흡광을 나타내는 그 밖의 화합물들이 많이 있다. 특히 핵산은 260nm에서 최대 흡수를 가지고 있지만 280nm에서도 흡광도가 상당히 크다. 그러 A280/A260을 알면 280nm에서의 핵산의 흡광에 대한 보정을 할 수 있다

2.Bradford

Bradford는 아주 낮은 pH조건입니다. 따라서 단백질에 따라 시간이 지날수록 응집이 발생하는 경우가 생길 수 있는데, 이경우에는 과량의 단백질이 순간적으로 낮은 pH에 노출되면서 나타나는 현상으로 보입니다. 그 이유는 total extract는 한종류만이 아니라 다양한 많은 종류의 단백질들이 섞여 있기 때문으로 단백질 고유의 특성에 의한 응집으로 보기 어렵기 때문입니다.

이런 경우엔, 단백질 용액을 약간 희석하여 사용하면 문제가 해결될 수 있습니다.

3.Lawry

Lowry Protein analysis method 1. Reagent 1.R1(alkaline phosphate) 2%(w/v) sodium carbone in 0.1N sodium hydroxide > sodium carbonate 20g과 sodium hydroxide 4g을 넣고 1000mL D.W. fill up 2. R2 1%(w/v) copper sulfate : CuSO4·5H2O 1g/100mL 3. R3 2% potassium tartrate : 2g/100mL 4. R4 Folin & Ciocalteu''s phenol reagent(Sigma F-9252, 2.0N)을 증류수로 1:1 희석 5. Lowry working soln.(분석직전에 만들 것) 50mL R1＋ 0.5mL R2＋ 0.5mL R3 → 세가지 시약을 혼합 6. Bovine serum albumin(BSA) stock standard 100mg albumin을 0.1N NaOH로 녹여 100mL까지 채운다.(albumin을 녹이면 거품이 약 간 생기므로 처음부터 100mL을 다 채우지 말고 완전히 녹여서 거품이 가라앉은후 fill up 2. Standard Conc.(mcg/ml) Stock(ml) 0.1N NaOH(ml) 0 0 1 50 0.05 0.95 100 0.1 0.9 200 0.2 0.8 400 0.4 0.6 600 0.6 0.4 800 0.8 0.2 1000 1 0 ※ 실험에 맞춰서 standard의 농도를 설정 3. Procedure 1. sample 0.5ml에 Lowry working soln을 4.5ml 넣어 혼합한 후 10분간 정치시킨다. 2. R4 0.5ml을 첨가한 후 그 즉시 혼합하여 20분간 세워둔다. 시약을 넣고 혼합하면 색이 짙은 남색 비슷하게 변하는데 그 색의 변화 범위가 넘으면 안된다. 이럴 경우는 NaOH로 희석해서 측정한다. 3. 750nm에서 측정

4.BCA

Bicinchoninic Acid Assay. Pierce방식이라고도 함.

샘플내에 있는 단백질 양을 측정하고자 할 때 쓰이는 것으로서, 단백질이 구리 이온Cu 2+, Cu 1+)을 환원 (Reduction) 시킬 수 있는 성질을 이용한다. 단백질에 의해 환원 된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서, 보라빛의 화합물을 생성하게 된다. 이 화합물은 빛의 특정 영역(562nm)에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액 각각보다 빛의 흡수율이 높기에, spectrophotometer를 사용해서 측정하면 흡수율 차이를 측정할 수 있다. 단백질의 양이 많으면 보다 많은 보라빛 화합물이 생성되었을테고, 그 화합물은 빛을 더 많이 흡수하니까 흡수율이 증가하고, 그것에 비례해서 샘플 안에 있는 단백질 양을 가늠한다. Lowry assay의 변형된 최근의 새로운 방법으로써 간단한 실험을 통하여 단백질을 정량할 수 있는 장점이 있다.

BCA정량법의 장단점

-BCA정량법의 장점

1. 일반적인 버퍼물질에 간섭을 덜 받는다

2. 높은 온도에서 한다면 아주 민감하고 빠른 반응을 할수 있다

3. 계면활성제와 같이 사용할 수 있다.

4. 반응시약이 안정적이다.

5. 서로다른 단백질 사이에 반응의 차이가 거의 없다

6.Lowry assay를 사용했을 때보다 방해를 주는 물질이 없다.

-BCA정량법의 단점

1. 실온에서 반응이 완전히 수행되지 않는다. 이것은 다량의 단백질을 정량 할 때 문제가 될 수 있다.

2. 농축된 단백질 샘플은 희석이 종종 필요하다.

3.단백질의 성질이 바뀐다.